SP、CGRP对去甲肾上腺素诱导的体外培养大鼠心肌细胞凋亡的调节及机制

【摘要】目的：观察NE作用下心肌细胞凋亡率、SP、CGRP及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、αB晶体蛋白(CryAB)的变化,从凋亡相关蛋白的角度探讨SP、CGRP对NE诱导的心肌细胞凋亡的影响及机制。方法：1新生大鼠心肌细胞的体外培养及鉴定。选用出生1-3d的SD大鼠建立新生大鼠心肌细胞体外培养模型,采用免疫细胞化学(IC)染色的方法对心肌细胞进行鉴定。2观察不同浓度及同一浓度作用不同时点下NE诱导的心肌细胞凋亡率的变化。(1)取30孔培养72h的心肌细胞随机分为对照组(不加干预药物)与10-5mol/LNE作用15min、30min、1h、3h组,每组n=6。在NE作用不同时点后采用FCM与TUNEL两种方法测定心肌细胞凋亡率的变化(每种方法每组3孔)。(2)取18孔培养72h的心肌细胞随机分为对照组(不加任何干预药物)与不同浓度NE组(NE终浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L),每组n=3。药物干预3h后采用流式细胞术(FCM)测定心肌细胞凋亡率的变化。3不同浓度NE对凋亡相关蛋白的影响。取18孔培养72h的心肌细胞随机分为对照组(不加任何干预药物)与不同浓度NE组(NE终浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L),每组n=3。药物作用3h后采用Westernblot的方法检测CryAB及凋亡相关因子Bcl-2、Bax及其比值的变化。4观察不同浓度NE对体外培养的心肌细胞SP、CGRP含量的影响。取18孔培养72h的心肌细胞随机分为对照组(不加任何干预药物)与不同浓度NE组(NE终浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L),每组n=3。药物作用3h后采用ELISA法测定各组细胞上清与蛋白中SP、CGRP的含量。5SP对NE诱导的凋亡率及相关凋亡蛋白的干预作用。将培养72h的心肌细胞随机分为对照组(不加任何干预药物)、NE组、SP+NE组、D-SP(SP的受体拮抗剂)+SP+NE组。以上各组中,NE、SP、D-SP终浓度分别为10-5mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L。每组n=3。药物作用3h后采用FCM测定凋亡率,采用Westernblot的方法检测CryAB及Bcl-2、Bax及其比值的变化,采用实时荧光定量PCR的方法检测CryABmRNA、Bcl-2mRNA、BaxmRNA及其比值的变化。6CGRP对NE诱导的凋亡率及相关凋亡蛋白的干预作用。将培养72h的心肌细胞随机分为对照组(不加任何干预药物)、NE组、CGRP+NE组、CGRP8-37(CGRP的受体拮抗剂)+CGRP+NE组。以上各组中,NE、CGRP、CGRP8-37终浓度分别为10-5mol/L、10-8Vol/L、10-7mol/L。每组n=3。药物作用3h后采用FCM测定心肌细胞凋亡率的变化,采用Westernblot的方法检测CryAB及Bcl-2、Bax及其比值的变化,采用实时荧光定量PCR的方法检测CryABmRNA、Bcl-2mRNA,BaxmRNA及其比值的变化。结果：1成功建立体外培养的新生大鼠心肌细胞培养模型。2(1)10-5mol/LNE作用不同时点(15min、30min、1h、3h)后心肌细胞凋亡率均升高(与对照组比较,均P<0.05),但以3h凋亡率最多。(2)不同浓度NE(10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L作用3h,均能诱导体外培养的新生大鼠心肌细胞凋亡率的上升(与对照组比较,均P<0.05),但以10-5mol/L作用下测得的凋亡率最高。3与对照组比较,不同浓度NE作用3h后,CryAB表达下降(均P<0.05),Bcl-2表达下降(除10-8mol/L外均P<0.05)、Bax表达上升(除10-7mol/L外均P<0.05),Bcl-2/Bax比值下降(均P<0.05)。4与对照组比较,不同浓度NE作用3h后,上清与心肌细胞蛋白中SP含量均下降；上清中CGRP含量均无显著变化(均P>0.05),心肌细胞蛋白中10-5、10-4mol/LNE作用下CGRP含量上升(P<0.05)。5与对照组比较,NE组凋亡率升高,CryAB、Bcl-2蛋白表达与mRNA均下降,Bax蛋白表达与mRNA均上升,Bcl-2/Bax比值下降(均P<0.05)。与NE组比较,SP+NE组凋亡率下降,CryAB、Bcl-2蛋白表达与mRNA升高,Bcl-2/Bax比值升高(均P<0.05),BaxmRNA下降而蛋白表达无显著改变。与SP+NE组比较,D-SP+SP+NE组凋亡率升高,CryAB、Bcl-2蛋白表达与mRNA均下降,Bcl-2/Bax比值下降(均P<0.05)、BaxmRNA升高但蛋白表达无变化(P>0.05)。6与对照组比较,NE组各项指标变化同前所述。与NE组比较,CGRP+NE组凋亡率下降,CryAB、Bcl-2蛋白表达与mRNA升高,Bcl-2/Bax比值升高(均P<0.05),Bax蛋白表达与mRNA无显著改变(均P>0.05)。与CGRP+NE组比较,CGRP8-37+CGRP+NE组凋亡率升高,CryAB、Bcl-2蛋白表达与mRNA下降、Bcl-2/Bax比值下降(均P<0.05),Bax蛋白表达与mRNA无显著改变(均P>0.05)。结论：1NE可以诱导体外培养的心肌细胞的凋亡率增加,CryAB、Bcl-2表达下降而Bax表达升高,Bcl-2/Bax比值下降。2NE可以诱导体外培养的心肌细胞的SP、CGRP含量改变。3SP与CGRP均可以抑制NE所引起的凋亡率的变化,其机制可能是与各自的特异性受体结合后改变凋亡相关蛋白的比例有关。
【作者】马艳霞；
【导师】郭政；
【作者基本信息】山西医科大学，生理学，2013，博士
【关键词】心肌细胞；凋亡；去甲肾上腺素；P物质；降钙素基因相关肽；Bcl-2；Bax；αB晶体蛋白；

【参考文献】
[1]李岩松,于文斌,张国庆,郭志忠,杨以涵,高桦.平方根Kalman自适应滤波及其在OCT中的应用[J].电力系统自动化,2005,11:53-56+73.
[2]秦习农.淮安市品牌农业竞争力研究[D].南京农业大学,农业推广,2011,硕士.
[3]王辉,徐慧.B-N链对锯齿型石墨烯纳米带电子结构的影响[J].材料导报,2012,24:140-144.
[4]莫昊.载银介孔氧化硅新型纳米抗菌材料体外抗菌性能及生物相容性能的实验研究[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[5]宋雪雷.基于小波变换和支持向量机的电能质量扰动分析方法[D].哈尔滨工业大学,2007.
[6]陈思云.春秋战国时期楚纹样的艺术形态研究[D].武汉纺织大学,设计艺术学,2014,硕士.
[7]胡进军.地下地震动参数研究[D].中国地震局工程力学研究所,防灾减灾工程及防护工程,2003,硕士.
[8]晏宇.含UPFC的同杆双回线路距离保护的研究[D].南京理工大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[9]王安南,顾培城.JC-A型检波器动态检测仪[J].石油地球物理勘探,1982,04:89-91.
[10]侯琳.教育家型校长培训策略研究[D].东北师范大学,教育经济与管理,2012,硕士.
[11]沈怡.南方丘陵地区农地整理项目规划设计技术与方法[D].西南农业大学,土地资源管理,2004,硕士.
[12]黄钊研.数值模拟技术在火灾控制中的应用[D].华南理工大学,2014.
[13]叶新火.检察机关提起民事公诉研究[D].华东政法学院,诉讼法,2004,硕士.
[14]殷林蓓.浅析程抱一小说《天一言》中的女性形象及其体现的道家思想[D].华东师范大学,法语语言文学,2013,硕士.
[15]于飞.基于短螺旋钻具旋挖钻机硬岩钻进的动力学研究[D].长安大学,机械电子工程,2013,硕士.
[16]杜忠遥.直驱永磁同步风力发电系统建模与仿真实现[D].南京师范大学,电工理论与新技术,2012,硕士.
[17]董艳.温控相转移手性Salen Mn（Ⅲ）配合物的设计及其在水相不对称催化反应中的催化性能研究[D].湖南师范大学,有机化学,2013,硕士.
[18]刘俊.湖南省体育专业招生术科考试项目设置及测试成绩变化分析研究[D].湖南师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[19]赵建辉,周易.工业用计算机安装环境标准(二)[J].冶金自动化,1985,02:48-54.
[20]习通源.青铜时代至早期铁器时代东天山地区聚落遗址研究[D].西北大学,考古学及博物馆学,2014,博士.
[21]杨子峰.双源CT低剂量扫描在结直肠癌术前评估中的临床应用[D].泰山医学院,影像医学与核医学,2012,硕士.
[22]杜婷.对外汉语教学中英语作为中介语的策略研究[D].西北师范大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[23]王圻宏.基于多电平变换的便携式移动电源的研制[D].重庆大学,控制工程（专业学位）,2014,硕士.
[24]尚鹏岳.银行现金备付金优化管理[D].浙江大学,2003.
[25]李峻媛.薏苡仁中常见真菌毒素的检测方法及不同储藏条件下真菌毒素含量变化的研究[D].成都中医药大学,药物分析,2012,硕士.
[26]韩建光,王赟,芦俊,胡莲莲,王彦嫱.弹性波Kirchhoff叠前深度偏移速度分析[J].石油地球物理勘探,2013,05:694-699+670+854.
[27]孔繁林.新型腰椎动态椎弓根螺钉的研制及其初步的生物力学研究[D].苏州大学,骨科,2013,硕士.
[28]丁纪云,蔡春娥.利用构造数据集评定数据挖掘过程的方法[J].湖南广播电视大学学报,2001,02:78-79.
[29]昌松,全海燕,罗敏学,郭毅.RMS分析技术在拖缆地震资料采集质量控制中的应用[J].石油地球物理勘探,2010,S1:13-17+239+245-246.
[30]辛齐.吉林网通小灵通产品营销策略研究[D].吉林大学,2005.
[31]厉荣.美国“叛逃者项目”研究（1951-1960）[D].东北师范大学,世界史,2012,硕士.
[32]方琦.中小学网络学习平台个性化推送系统的研究与设计[D].浙江工业大学,2013.
[33]杨青.爱丽思营销管理案例研究[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[34]陈璟怡.不同输入方式对英语附带词汇习得的影响[D].湖北大学,课程与教学论,2012,硕士.
[35]郭伟刚,鞠时光.制造企业面向销售的通用智能商务系统研究[J].佛山科学技术学院学报(自然科学版),2005,04:40-43.
[36]白勇.湖南省新型城镇化发展研究[D].湖南大学,公共管理,2014,硕士.
[37]本报记者郭文鹃.苹果的心思你来猜[N].经济日报,2014-05-02005.
[38]卢国锋.聚焦高考化学易错知识点(一)[J].中学生理科应试,2015,01:48-49.
[39]黄娴.正交小波包复用系统的峰均功率比问题研究[D].华侨大学,电子与通信工程（专业学位）,2014,硕士.
[40]冉杨鋆.基于Lasso极限最小学习机和LAB颜色空间的人脸识别研究[D].复旦大学,计算机系统结构,2012,硕士.
[41]王淼.甘肃农业结构调整的经济增长效应分析[D].西北师范大学,产业经济学,2013,硕士.
[42]王荣全.20世纪50年代初大陆与台湾土地改革比较研究[D].南京师范大学,专门史,2012,硕士.
[43]王琳.腹腔镜下常见妇科手术的临床应用优势分析[D].大连医科大学,妇产科学,2012,硕士.
[44]邹倩.基于BIM的城市更新项目物理环境评价模型研究[D].重庆大学,技术经济及管理,2014,硕士.
[45]谢结来,张欲晓,李正中,代双和,陈元忠,郭增虎.冰川沉积储集层的识别与评价[J].石油地球物理勘探,2013,S1:115-119+203+10.
[46]单春玲.浅谈CRM中的商务智能技术[J].市场周刊(商务营销),2004,01:59-61.
[47]伏清欢.盆底重建术治疗盆腔器官脱垂的临床研究[D].山东大学,临床医学（专业学位）,2013,硕士.
[48]曾荣杰.IBM－PC／XT机与单片机通信系统的应用[J].冶金自动化,1996,01:34-37.
[49]陈命阵.厦门港口发展的战略规划研究[D].厦门大学,工商管理,2014,硕士.
[50]刘粉林,王银河,张嗣瀛.具有不确定未知界的相似组合系统的鲁棒分散输出控制[J].自动化学报,2000,03:332-338.